1什么是荧光原位杂交
荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization,FISH)是在20世纪80年代末在放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性分子细胞遗传技术,以荧光标记取代同位素标记而形成的一种新的原位杂交方法,探针首先与某种介导分子(reporter molecule)结合,杂交后再通过免疫细胞化学过程连接上荧光染料.FISH的基本原理是将DNA(或RNA)探针用特殊的核苷酸分子标记,然后将探针直接杂交到染色体或DNA纤维切片上,再用与荧光素分子偶联的单克隆抗体与探针分子特异性结合来检测DNA序列在染色体或DNA纤维切片上的定性、定位、相对定量分析.FISH具有安全、快速、灵敏度高、探针能长期保存、能同时显示多种颜色等优点,不但能显示中期分裂相,还能显示于间期核.同时在荧光原位杂交基础上又发展了多彩色荧光原位杂交技术和染色质纤维荧光原位杂交技术.
2荧光原位杂交的临床应用有哪些
1、临床细胞遗传学：有助于进一步证实染色体带型，用于确定标记染色体的起源。
对于染色体亚显微缺失的检测很敏感，由于诊断显微缺失综合征。
2、产前诊断：染色体异常的产前诊断主要依靠细胞分裂中期染色体的分析，但这一常规细胞遗传学方法需要两至三周完成。而应用生物素标记的染色体特异性探针对未经培养的绒毛细胞或羊水细胞进行原位交杂即可快速诊断常见的三体型及性染色体数目畸变。
使用这一方法进行染色体数目异常的产前诊断只需要一天的时间，可以省去复杂的细胞培养及染色体分析过程。
另外，FISHA在染色体结构异常的产前诊断中，不仅对那些易位性重排，而且对重复，缺失或者插入性重排都能为确定类型，来源和断裂点提供可靠依据。对标记染色体，环状染色体来源的研究中，FISH也具有高度的敏感性和可靠性。
3、肿瘤诊断：肿瘤细胞的染色体常常发生易位、缺失、倒位与扩增等改变，而肿瘤细胞的分裂指数较低而且分裂相显带困难，经常很难分析。
染色体荧光原位杂交技术的应用，使大部分上述改变的阐明大为简化。
4、传染性疾病的诊断：诊断病原体的程序已有报告。
3荧光原位杂交的特点是什么
原位杂交的探针按标记分子类型分为放射性标记和非放射性标记。用同位素标记的放射性探针优势在于对制备样品的要求不高，可以通过延长曝光时间加强信号强度，故较灵敏。
缺点是探针不稳定、自显影时间长、放射线的散射使得空间分辨率不高、及同位素操作较繁琐等。采用荧光标记系统则可克服这些不足，这就是 FISH技术。FISH技术作为非放射性检测体系，有以下特点。
优点:
1、荧光试剂和探针经济、安全;
2、探针稳定，一次标记后可在两年内使用;
3、实验周期短、能迅速得到结果、特异性好、定位准确;
4、FISH可定位长度在1kb的DNA序列，其灵敏度与放射性探针相当;
5、多色FISH 通过在同一个核中显示不同的颜色可同时检测多种序列;
6、既可以在玻片上显示中期染色体数量或结构的变化，也可以在悬液中显示间期染色体DNA的结构。
缺点：不能达到100%杂交，特别是在应用较短的cDNA探针时效率明显下降。
4荧光原位杂交的实验步骤有哪些
仪器设备
1、 医用微波炉;
2、 水浴锅;
3、荧光显微镜;
4、数字显微照相机。
FISH试剂
(1)1×PBS：由10×PBS溶液稀释而成，储存于4℃;
(2)20×SSC(pH7.0);
(3)2×SSC，由20×SSC溶液稀释而成;
(4)25mg/ml蛋白酶K消化液。
(5)变性液(70%甲酰胺+2×SSC，pH7.0)：4ml 20×SSC;8ml蒸馏水;28ml甲酰胺。每次新鲜配制。
(6)杂交后洗涤液： 20×SSC 4ml;蒸馏水16ml;甲酰胺20ml。每次新鲜配制。
调节pH前升至室温。
(7)封闭液I：体积分数5% BSA 3 mL，20×SSC 1 mL，ddH2O 1mL，Tween20 5 μL混合。
(8)封闭液II：体积分数5% BSA 3mL，20×SSC 1mL，goat serum 250 μL，ddH2O 750 μL，Tween20 5 μL混合。
(9)荧光检测试剂稀释液：体积分数5% BSA 1mL，20×SSC 1mL，ddH2O 3mL，Tween20 5μL混合。
实验步骤
1、脱蜡：
1)二甲苯脱蜡3次，每次5min;
2)100%酒精两次，每次2min;
3)移出酒精，斜置切片，标记末段向下，空气干燥。
2、蛋白酶处理:
1)每个染色缸40ml蛋白酶K消化溶液，配制方法如下：2×SSC 40ml倒人Facal管，在水浴槽中预热。将消化酶液加入管内，摇动直到酶溶解。
2) 37℃水浴槽中预热染色缸和蛋白酶K溶液。37℃孵育20min。
3) ×SSC在室温下漂洗切片3次，每次1min。
4)梯度酒精脱水(-20℃预冷)。
3、变性：
1)每一个立式染色缸配制40ml变性溶液;
2)78℃水浴槽中平衡预热混合液染色缸;
3)78℃孵育8min;
4) 即移入-20℃预冷70%酒精的染色缸内2min，再依次移入80%、90%和100%的-20℃预冷酒精内，每缸2min;
5)空气干燥。
4、杂交：
1)准备探针;
2)取一个较大的湿盒，交叉放置切片;
3)滴10μl探针在切片的组织上，加盖玻片;
4)盖上湿盒盖，37℃孵育12h～16h。
杂交后的水洗：
5)镊子小心去除盖玻片;
6)43℃预热杂交后水洗溶液40ml水洗切片15min;
7)2×SSC(37℃)洗两次，每次10min;
8)切片放人染色缸的1×PBS内待检测，勿使切片干燥。
检测：
9)从1×PBS中取出切片，除去过多的水分，避免标本干燥。把切片放入湿盒内，同时处理4张切片。
10)每张切片使用30μl～60μl罗丹明抗-地高辛抗体或FITC卵白素，室温下孵育20min;
11)去掉塑料盖膜，把切片放入含1×PBS的染色缸。
1×PBS室温下洗3次，每次2min。
12)从1×PBS中取出切片，斜置切片使液体排出;
13)每张切片滴30μl～60μl抗-卵白素抗体，加塑料盖膜，室温孵育20min;
14)去掉塑料盖膜，把切片放人含1×PBS的染色缸。
1×PBS室温下洗3次，每次2min;
15)从1×PBS中取出切片，斜置切片使液体排出;
16)每张切片滴30μl～60μl抗-卵白素抗体，加塑料盖膜，室温孵育20min;
17)1×PBS室温下洗3次，每次2min。
5、细胞核染色：
1)张切片加10μl～20μl DAPI，覆盖盖玻片并在室温下孵育2～5ml;
2)尽可能快的在荧光显微镜下观察或封闭盒内保存在-20℃冰箱。切片在染色之后1h内可以在显微镜下观察。
6. 荧光显微镜观察FISH结果
先在可见光源下找到具有细胞分裂相的视野，然后打开荧光激发光源，FITC的激发波长为490 nm。
细胞被PI染成红色，而经FITC标记的探针所在的位置发出绿色荧光。
5荧光原位杂交的实验原理是什么
荧光原位杂交(Fluorescence in situ hybridization FISH)是一门新兴的分子细胞遗传学技术，是20世纪80年代末期在原有的放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性原位杂交技术。目前这项技术已经广泛应用于动植物基因组结构研究、染色体精细结构变异分析、病毒感染分析、人类产前诊断、肿瘤遗传学和基因组进化研究待许多领域。
FISH的基本原理是用已知的标记单链核酸为探针，按照碱基互补的原则，与待检材料中未知的单链核酸进行异性结合，形成可被检测的杂交双链核酸。由于DNA分子在染色体上是沿着染色体纵轴呈线性排列，因而可以探针直接与染色体进行杂交从而将特定的基因在染色体上定位。与传统的放射性标记原位杂交相比，荧光原位杂交具有快速、检测信号强、杂交特异性高和可以多重染色等特点，因此在分子细胞遗传学领域受到普遍关注。
杂交所用的探针大致可以分类三类：
1)染色体特异重复序列探针，例如α卫星、卫星III类的探针，其杂交靶位常大于1Mb，不含散在重复序列，与靶位结合紧密，杂交信号强，易于检测;
2)全染色体或染色体区域特异性探针，其由一条染色体或染色体上某一区段上极端不同的核苷酸片段所组成，可由克隆到噬菌体和质粒中的染色体特异大片段获得;
3)特异性位置探针，由一个或几个克隆序列组成。
探针的荧光素标记可以采用直接和间接标记的方法。
间接标记是采用生物素标记DNA 探针，杂交之后用藕联有荧光素亲和素或者链霉亲和素进行检测，同时还可以利用亲和素-生物素-荧光素复合物，将荧光信号进行放大，从而可以检测500bp 的片段。
而直接标记法是将荧光素直接与探针核苷酸或磷酸戊糖骨架共价结合，或在缺口平移法标记探针时将荧光素核苷三磷酸掺入。直接标记法在检测时步骤简单，但由于不能进行信号放大，因此灵敏度不如间接标记的方法。
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