连续划线法步骤：从平板边缘一点开始，连续作波浪式划线直到平板的另一端为止，当中不需灼烧接种环上的菌。接种环于酒精灯外焰烧至红透，接种棒也要充分灼烧，最后再集中烧接种环至红。
1、轻轻摇匀待接种试管，左手手心托待接种试管底侧部，右手执接种环，右手小指拔下试管塞，于酒精灯附近将接种环伸进试管，稍候，再插入待接接种液中，蘸一下，取满一环，抽出、烧塞、盖盖、放回试管架。
或将接种环通过稍打开皿盖的缝隙伸入平板，在平板边缘空白处接触一下使接种环冷却，然后以无菌操作接种环直接取平板上待分离纯化的菌落。
2、靠近酒精灯处打开平皿盖约30°，右手将环伸进平皿，将菌种点种在平板边缘一处，轻轻涂布于琼脂培养基边缘，抽出接种环，盖上平皿盖，然后将接种环上多余的培养液在火焰中灼烧，打开平皿盖约30°伸入接种环。
3、待接种环冷却后，再与接种液处轻轻接触，开始在平板表面轻巧滑动划线，接种环不要嵌入培养基内划破培养基，线条要平行密集，充分利用平板表面积，注意勿使前后两条线重叠，划线完毕，关上皿盖。灼烧接种环，待冷却后放置接种架上。
培养皿倒置于适温的恒温箱内培养（以免培养过程皿盖冷凝水滴下，冲散已分离的菌落）。培养后在划线平板上观察沿划线处长出的菌落形态，镜检后再接种斜面。
划线分离主要有分区划线局猛法和连续划线法两种。
分区划线法分离时平板分四个区，故又称四分区划线法。划线时每次伏睁将平板转动60~70°划线，每换一次角度，应将接种环上的菌烧死后，再通过上次划线处划线。
其中第4区是单菌落的主要分布区，故其划线面积应最大。为防止第4区内划线与1、2、3区线条相接触，应使4区线条与1区线条相平行，这样区与区间线条夹角最好保持120°左右。
1、先将接种环沾取少量菌在平板1区划3~5条平行线，取出接种环，左手关上皿盖，将平板转动60~70°，右手把接种桐厅桥环上多余菌体烧死，将烧红的接种环在平板边缘冷却，再按以上方法以1区划线的菌体为菌源，由1区向2区作第2次平行划线。
2、第2次划线完毕，同时再把平皿转动约60~70°，同样依次在3、4区划线。划线完毕，灼烧接种环，关上皿盖，同上法培养，在划线区观察单菌落。
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